Informatie

3.2: Natuurlijke en onnatuurlijke groepen - Biologie

3.2: Natuurlijke en onnatuurlijke groepen - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Het is de moeite waard om te herhalen dat hoewel een soort kan worden gezien als een natuurlijke groep, de hogere classificatieniveaus al dan niet biologisch belangrijke informatie weerspiegelen. We kunnen er zeker van zijn dat we hetzelfde boek lezen en hetzelfde organisme bestuderen!

Geslachten en andere classificaties op een hoger niveau zijn over het algemeen gebaseerd op een beslissing om een ​​of meer eigenschappen belangrijker te vinden dan andere. Het toekennen van een bepaalde waarde aan een eigenschap kan willekeurig lijken. Laten we bijvoorbeeld eens kijken naar het geslacht Canis, dat wolven en coyotes omvat, en het geslacht Vulpes, dat vossen omvat. Het onderscheid tussen deze twee groepen is gebaseerd op kleinere en plattere schedels in Vulpes in vergelijking met Canis. Laten we nu eens kijken naar het geslacht Felis, de gewone huiskat, en het geslacht Panthera, dat tijgers, leeuwen, jaguars en luipaarden omvat. Deze twee geslachten onderscheiden zich door schedelkenmerken en of ze nu (Pathera) of niet (Felix) kunnen brullen. Dus wat maken we van dit onderscheid, zijn ze echt voldoende om verschillende groepen te rechtvaardigen, of moeten Canis en Vuples (en Felix en Panthera) worden samengevoegd? Zijn de verschillen tussen deze groepen biologisch zinvol? Het antwoord is dat de basis voor classificaties van hogere orde vaak niet biologisch zinvol is. Dit algemene gebrek aan biologische betekenis wordt onderstreept door het feit dat de classificatie van een organisme van hogere orde kan veranderen: een geslacht kan een familie worden (en vice versa) of een soort kan van de ene geslachten naar de andere worden verplaatst. Overweeg de soorten organismen die algemeen bekend staan ​​​​als beren. Er zijn een aantal verschillende soorten beerachtige organismen, een feit dat het classificatieschema van Linnaeus erkende. Als we naar alle beerachtige organismen kijken, herkennen we acht soorten.59 We beschouwen er momenteel vier, de bruine beer (Ursus arctos), de Aziatische zwarte beer (Ursus thibetanus), de Amerikaanse beer (Ursus americanus) en de ijsbeer (Ursus maritimus), als significant meer op elkaar lijkend. op de aanwezigheid van verschillende eigenschappen, dan bij andere soorten beren. We hebben ze daarom in hun eigen geslacht, Ursus, geplaatst. We hebben elk van de andere soorten beerachtige organismen, de brilbeer (Tremarctos ornatus), de lippenbeer (Melurus ursinus), de zonnebeer (Helarctos mayalanus) en de reuzenpanda (Ailuropoda melanoleuca) in hun eigen aparte geslacht, omdat wetenschappers deze soorten meer van elkaar onderscheiden dan de leden van het geslacht Ursus. Het probleem hier is hoe groot deze verschillen moeten zijn om een ​​nieuw geslacht te rechtvaardigen?

Dus waar laat dat ons? Hier komen de evolutietheorie samen met de cel (continuïteit van het leven) theorie samen. We gaan uit van de veronderstelling dat hoe nauwer verwant (evolutionair) twee soorten zijn, hoe meer eigenschappen ze zullen delen en dat de ontwikkeling van nieuwe, biologisch significante eigenschappen de groep onderscheidt van de andere. Eigenschappen die ten grondslag liggen aan een rationeel classificatieschema staan ​​bekend als synapomorfieën (een technische term); in feite zijn dit eigenschappen die in het ene of het andere vertakkingspunt van een stamboom voorkomen en dienen om dat vertakkingspunt te definiëren, zodat het organisme op de ene tak deel uitmaakt van een "natuurlijke" groep, verschillend van die op de andere tak (afstamming) . Net zoals de vervorming van ruimte-tijd een reden gaf waarom er een wet van zwaartekracht is, zo bieden de voorouderlijke relaties tussen organismen een reden waarom organismen kunnen worden gerangschikt in een Linnaean-hiërarchie.

Dus de resterende vraag is, hoe bepalen we de afkomst wanneer de voorouders leefden, duizenden, miljoenen of miljarden jaren in het verleden. Omdat we niet terug in de tijd kunnen reizen, moeten we relaties afleiden uit vergelijkende studies van levende en gefossiliseerde organismen. Hier speelde de bioloog Willi Hennig een sleutelrol.60 Hij stelde regels op voor het gebruik van gedeelde, empirisch meetbare eigenschappen om voorouderlijke relaties te reconstrueren, zodat elke groep één gemeenschappelijke voorouder zou moeten hebben. Zoals we later zullen ontdekken, is een van de kenmerken die nu vaak worden gebruikt in moderne studies, gegevens over de gen- (DNA-)sequentie en genomische organisatie, hoewel er zelfs hier tal van situaties zijn waarin er onduidelijkheden blijven bestaan, vanwege de zeer lange tijd die het scheiden van voorouders en hedendaagse organismen.


Een faagweergavesysteem met onnatuurlijke aminozuren

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.


1. Inleiding

Eiwitten zijn essentiële componenten van synthetische cellulaire netwerken. Synthese van cellulaire paden met het uiteindelijke doel om functionele kunstmatige cellen te creëren, kan veel baat hebben bij het genereren van eiwitten met gewenste eigenschappen die effectief kunnen worden gereguleerd. Eiwitten die onafhankelijk van de endogene circuits van het gastheerorganisme kunnen functioneren, vereisen verdere ontwikkelingen in het ontwerp van "onderdelen".

De recente vorderingen bij het opnieuw toewijzen van de genetische code aan onnatuurlijke aminozuren (UAA's) 12,14-16 breiden de moleculaire gereedschapskist van eiwit "onderdelen" uit. In feite kan de introductie van UAA nieuwe functies verlenen die moeilijk of onmogelijk te creëren zijn met eiwitten die bestaan ​​uit de natuurlijke bouwstenen van 20 aminozuren, zoals foto-geïnduceerde omschakeling, 17 IR-probe actieve 18 en redoxgevoelige 19 eiwitten. Bovendien kunnen eiwitten die UAA's dragen, resulteren in verbeterde eigenschappen zoals hyperstabiliteit 20,21 en proteaseresistentie. 22 Dergelijke kenmerken kunnen nuttig zijn voor het afstemmen van orthogonale eiwitten in de context van synthetische biologische netwerken. Hier bespreken we benaderingen die zich richten op eiwittechnologie en die mogelijk synthetische biologiemethoden kunnen uitbreiden door UAA-opname voor de creatie van kunstmatige eiwitten.


Biologische vaardigheden die je leert

  • Verken veel van de brede concepten die ten grondslag liggen aan ons begrip van de natuurlijke wereld.
  • Ervaring opdoen met het implementeren van de wetenschappelijke methode, inclusief het testen van hypothesen, experimenteel ontwerp, toegang tot en begrip van de wetenschappelijke literatuur en het analyseren van gegevens.
  • Verwerf de kennis en praktische vaardigheden die nodig zijn om zeer competitief te zijn voor uitzonderlijke carrièremogelijkheden na het afstuderen of door te gaan naar een graduaat.

Sjabloonsynthese van niet-natuurlijke nucleïnezuren

De fosforamidietbenadering van DNA-synthese in vaste fase [38, 39], ontwikkeld in het begin van de jaren tachtig, leidde tot het algemene gebruik van synthetisch DNA in een groot aantal toepassingen. Evenzo kan worden verwacht dat verbeteringen in de synthese van XNA's het gebruik ervan zullen verhogen en nieuwe toepassingen zullen ontsluiten in de komende decennia. XNA-synthese kan grofweg worden onderverdeeld in enzymatische en niet-enzymatische benaderingen. Sommige veelgebruikte XNA's (bijv. 2′OMe, LNA, PS, 2′MOE) kunnen chemisch worden gesynthetiseerd, hoewel de opbrengsten van zelfs de meest synthetisch toegankelijke XNA's beperkt zijn tot ongeveer 150 bp [40]. Voor andere XNA-chemie is geen betrouwbare vaste-fase-syntheseroute bekend [41]. Bovendien hangt synthese in vaste fase af van expliciete kennis van de sequentie die wordt gesynthetiseerd. Daarentegen maakt sjabloonsynthese algemene informatieoverdracht mogelijk en is essentieel voor de evolutie van functionele oligonucleotiden.

Niet-enzymatische sjabloonsynthese

Niet-enzymatische template-synthese maakt traditioneel gebruik van geactiveerde nucleotiden of korte oligonucleotide-bouwstenen die zichzelf organiseren op een template via base-paring-interacties en reageren om te polymeriseren. Het kopiëren van dergelijke sjablonen, ontwikkeld in de jaren 70 [42,43,44], is uitgebreid tot verschillende XNA-chemieën [45,46,47,48,49,50,51,52,52,53], vaak in de context van prebiotisch nucleïnezuur. zuur replicatie. Systemen voor sjabloonreplicatie van PNA-pentameren [54, 55] met behulp van reductieve aminering zijn bijvoorbeeld efficiënt genoeg om modelselectie-experimenten mogelijk te maken [56]. Vergelijkbare strategieën zijn ook gebruikt om nucleïnezuren te assembleren via door koper gekatalyseerde klikligatie van oligonucleotiden [57, 58] en door fosforamidaatligatie [59], en de resulterende backbones hebben enige biocompatibiliteit getoond [60]. In een interessante uitbreiding van dit werk zijn nucleïnezuurtemplates ook gebruikt om chemische entiteiten op nabijheid te organiseren voor geprogrammeerde reacties [61,62,63]. In het bijzonder heeft de Liu-groep dergelijke matrijssynthesebenaderingen uitgebreid om diverse niet-nucleïnezuurentiteiten chemisch te ligeren in precieze sequenties gedefinieerd door een DNA-sjabloon [64]. Dergelijke chemische syntheses met sjabloon maken het mogelijk dat steeds meer uiteenlopende chemieën worden gesynthetiseerd en gerepliceerd zonder de polymeerdiversiteit te beperken door het vermogen van de samenstellende monomeren ervan om te dienen als substraten voor polymerasen of andere nucleïnezuurmodificerende enzymen.

Enzymatische ligatie en modificatie van XNA's

Van verschillende DNA-ligasen is aangetoond dat ze niet-natuurlijke substraten accepteren en zijn alleen of in combinatie met XNA-polymerasen gebruikt om XNA-oligonucleotiden te synthetiseren. Net als de bovengenoemde chemische ligatiestrategieën, maakt enzymatische ligatie van vooraf georganiseerde oligomeren op een sjabloon het positioneren van gemodificeerde nucleotiden, waaronder meerdere verschillende modificaties, op gedefinieerde loci mogelijk. Onlangs is aangetoond dat verschillende commercieel verkrijgbare ligasen de ligatie van XNA-substraten kunnen katalyseren, waaronder 2′OMe, HNA, LNA, TNA en FANA [41, 65]. Bovendien hebben rationele ontwerp- en moleculaire modelleringsbenaderingen nu geresulteerd in de eerste XNA-matrijs XNA-ligase [66]. De Liu- en Hili-groepen hebben ook uitgebreid gewerkt met ligase-gemedieerde synthese van gemodificeerd DNA van divers gefunctionaliseerd DNA 3- of 5-meren [67, 68], waardoor een grote verscheidenheid aan modificaties mogelijk is, waaronder hydrofobe, alifatische, aromatische, zure en basisdelen, die moeten worden opgenomen met behulp van deze korte "quasicodons". In overeenstemming met resultaten verkregen met SOMAmer-selecties (Slow Off-rate Modified Aptamer) [22], vinden ze dat functionalisering met niet-polaire delen een snellere selectieconvergentie en sterkere aptamerbinding lijkt te bevorderen [21]. Door chemische diversiteit op te nemen die verder gaat dan die gevonden in eiwitten (bijv. Gehalogeneerde residuen), isoleerde de groep aptameren met hoge affiniteit tegen PCSK9 en interleukine-6 ​​[69]. De bovenstaande strategieën omvatten het paradigma van het benutten van de unieke eigenschappen van nucleïnezuren (d.w.z. gecodeerde synthese, evolueerbaarheid) in combinatie met een uitgebreide reeks chemische substituenten om functionele moleculen met therapeutisch potentieel te creëren.

Polymerasesynthese van XNA's

Enzymatische polymerisatie van nucleïnezuren is orden van grootte sneller en nauwkeuriger dan chemisch kopiëren of synthese en wordt nu nagestreefd voor de volgende generatie DNA-oligonucleotidesynthese [70, 71], met als doel de fosforamidiettechnologie te vervangen. Evenzo kan enzymatische XNA-synthese de productie van XNA-oligonucleotiden vergemakkelijken. XNA's met chemisch conservatieve modificaties worden door natuurlijke polymerasen als substraten geaccepteerd, terwijl de engineering van polymerasen om een ​​breder scala aan XNA-substraten te accepteren ook met succes is verlopen [72, 73]. Sommige polymerasen zijn inderdaad zeer geschikt gebleken voor nieuwe substraten. Thermofiele B-familie polymerasen, vooral die van Pyrococcus en Thermokoken genera zijn bijzonder geschikt gebleken voor engineering voor XNA-substraten [33, 74,75,76,77,78,79,80,81]. Deze functionele plasticiteit kan worden ondersteund door een hoge thermostabiliteit, die een grotere tolerantie bevordert voor mutaties die anders overmatig destabiliserend zouden zijn. Echter, A-familie [82,83,84,85,86,87,88,89,90] en mesofiele polymerasen zoals Phi29 [91,92] evenals RNA-polymerasen [93,94,95,96,97 ] zijn ook ontworpen om XNA-substraten met succes te accepteren (tabel 1). De efficiëntie, betrouwbaarheid en kinetiek van gemanipuleerde polymerasen op XNA-substraten worden echter gewoonlijk aangetast ten opzichte van de natieve enzymen en natuurlijke substraten. Vaak zijn "forcerende" omstandigheden (bijv. superstoichiometrische polymeraseconcentraties of de aanwezigheid van Mn2+, wat op zijn beurt de betrouwbaarheid vermindert) nodig om de synthetische opbrengsten te verhogen [106].

Profiteren van de promiscuïteit van natuurlijke polymerasen

Het is misschien opmerkelijk dat natuurlijke polymerasen überhaupt gemodificeerde nucleotiden kunnen opnemen, gezien hun behoefte aan stringente substraatspecificiteit en nauwkeurigheid. Op sommige posities in het nucleotide worden modificaties echter gemakkelijk getolereerd. Modificaties op de C5-positie van pyrimidinen en C7-positie van N7-deaza-purines projecteren bijvoorbeeld in de hoofdgroef van de duplex en interfereren niet met de Watson-Crick-basenparing. Daarom worden zelfs omvangrijke adducten op deze posities over het algemeen goed verdragen door polymerasen [22, 107,108,109,110,111,112]. Enzymatische synthese van nucleotiden met reactieve groepen (bijvoorbeeld voor door koper gekatalyseerde klikchemie) op deze posities kan uitgebreide postsynthetische modificaties mogelijk maken [113,114,115,116,117].

De plasticiteit van polymerasen heeft onderzoekers ook in staat gesteld om op grote schaal natuurlijke basen te vervangen door nauwe chemische analogen [118, 119]. In sommige gevallen is de synthese efficiënt genoeg om gemodificeerde PCR-producten tot 1,5 kb te produceren [119]. Bovendien zijn er geheel nieuwe onnatuurlijke basenparen (UBP's) ontwikkeld op basis van nieuwe patronen voor waterstofbinding [105, 120], hydrofobiciteit [121, 122] en complementariteit van vormen [123,124,125]. Deze UBP's kunnen worden gerepliceerd door gemanipuleerde en natuurlijke polymerasen, waarmee succesvolle uitbreiding van de genetische code wordt aangetoond en recentelijk informatie wordt gecodeerd in een ongekend genetisch achtletterig alfabet [120].

XNA-synthese in vivo

De synthese en replicatie van XNA's in vivo vertegenwoordigt een belangrijke grens in XNA-onderzoek naar doelen zoals stabiele codering van onnatuurlijke aminozuren en genetische orthogonaliteit voor "firewalling" van synthetische biologie. Hiertoe is nu volledige vervanging van cytidine en/of thymidine door 5-gesubstitueerde pyrimidine-analogen in bacteriële genomen bereikt door zorgvuldige metabolische engineering en evolutie [126,127.128,129].

Opmerkelijk is dat Romesberg en collega's hebben kunnen engineeren E coli stammen met het vermogen om hun onnatuurlijke NaM-TPT3-basenpaar te repliceren en te behouden in zowel plasmide [130] als genomische [131] contexten. Om dit te bereiken, ontwikkelden ze een nucleoside-trifosfaattransporter [132], riepen Cas9 op om sequenties te degraderen die de UBP hadden verloren, en maakten verschillende aanpassingen aan de E coli DNA-synthese en reparatiemachines. Ze demonstreerden verder de compatibiliteit van de UBP met vertaalmachines om plaatsspecifiek te coderen voor onnatuurlijke aminozuren [133, 134]. Andere semi-synthetische organismen met gesubstitueerde genomen of het vermogen om UBP's te verspreiden, zullen waarschijnlijk op deze vroege successen volgen [135, 136].

Gerichte evolutie voor XNA-polymerase-engineering

Hoewel modificaties van basen en zelfs volledig nieuwe basenparen in verschillende mate door natuurlijke polymerasen worden getolereerd, blijken modificaties aan de suiker en de ruggengraat over het algemeen een grotere uitdaging te zijn, vooral bij volledige substitutie. Om de activiteit met dergelijke onnatuurlijke substraten te verbeteren, worden vaak polymerase-engineeringbenaderingen gebruikt, variërend van rationele engineering gedreven door structurele inzichten of computationele analyse tot screening en gerichte evolutie. Hiervan zijn op emulsie gebaseerde methoden en faagdisplay bijzonder nuttig [137, 138].

In het veld is een reeks gerichte evolutiestrategieën toegepast. Gecompartimenteerde zelfreplicatie (CSR) [139,140,141] daagt polymerasen uit om hun eigen gen in een emulsiecompartiment door middel van PCR te amplificeren. De exponentiële verrijking van zeer actieve klonen, in tegenstelling tot eenvoudige partitionering van actieve varianten, maakt CSR tot een krachtige methode. Het stelt echter strenge eisen aan de prestaties van polymerase, die enigszins worden verlicht in short-patch CSR (spCSR) [85] waar amplificatie beperkt is tot slechts een korte sectie van het polymerase-gen. Geneste CSR maakt selectie mogelijk van sequenties of kenmerken die niet aanwezig zijn in het polymerase-gen zelf (bijv. Nieuwe basenparen, reverse transcriptie van XNA-templates) door gebruik te maken van out-nesting primers met deze kenmerken tijdens de CSR-amplificatiestap [79, 86]. Een verdere uitbreiding genaamd gecompartimenteerde partnerreplicatie (CPR) kan worden gebruikt om te selecteren op andere enzymatische activiteiten dan nucleïnezuurpolymerisatie door de selecteerbare PCR-reactie te beperken door de geschiktheid van een partnergen [86, 142]. Onlangs is CSR ook aangepast voor isothermische amplificatiereacties (iCSR), zowel bij hoge temperaturen [143] als bij lagere temperaturen voor de ontwikkeling van niet-thermostabiele enzymen [91]. Gecompartimenteerde self-tagging (CST) [144] maakt selectie mogelijk voor veel moeilijkere substraten of omstandigheden. De selectie is gebaseerd op een primerverlenging die wordt getemperd door het coderende plasmide. De gebiotinyleerde primer samen met eventuele plasmiden die zijn "gevangen" door voldoende primerverlenging, worden verdeeld over streptavidineparels. CST heeft polymerasen opgeleverd voor een reeks XNA's [78], meest recentelijk voor dxNA [145]. In tegenstelling tot bulkemulsificatiemethoden zijn microfluïdische apparaten gebruikt om zeer homogene emulsiedruppels te genereren, waardoor het vermogen om kleine incrementele verbeteringen die belangrijk zijn bij stapsgewijze selecties nauwkeurig te onderscheiden [146, 147] wordt verbeterd. Een andere gerichte evolutiestrategie is faagdisplay, waarbij polymerasen die op faagdeeltjes worden weergegeven, worden uitgedaagd om een ​​primer te verlengen met scheidbare (bijvoorbeeld gebiotinyleerde) nucleotiden [80, 89, 148]. In een opmerkelijk recent gebruik van faagdisplay voor polymerase-evolutie, Chen et al. identificeerde verschillende Taq-varianten die in staat zijn om 2′OMe-RNA [88] te synthetiseren en omgekeerd te transcriberen, een XNA die van bijzonder belang is voor therapieën vanwege de hoge biostabiliteit en nucleaseresistentie.

Rationele engineering van XNA-polymerasen: structurele inzichten

Polymerasen maken tijdens de katalytische cyclus veel belangrijke contacten met het binnenkomende nucleotidetrifosfaat en de primerstreng [149]. Structuren van polymerasen in complex met gemodificeerde substraten kunnen daarom helpen bij zowel rationele engineering als retrospectief begrip van XNA-polymerasen. Onlangs hebben Kropp et al. loste ternaire structuren van KlenTaq-polymerase op met een C5-gemodificeerd cytidine op elk van zes opeenvolgende posities [150] in de katalysecyclus, waarbij de beweging van het gemodificeerde substraat door de actieve plaats van het polymerase werd gerecapituleerd en een verrassend niveau van flexibiliteit in zowel het gemodificeerde nucleotide werd onthuld en de interagerende polymeraseresiduen om de modificatie te accommoderen.

Verder structureel inzicht in XNA-polymerisatie is gerapporteerd door Singh et al. [151] met structuren van een gemanipuleerde KlenTaq in een binair pre-incorporatie en een ternair post-incorporatie complex met het onnatuurlijke basenpaar dZ:dP. Hoewel geen van de gemuteerde aminozuren in direct contact staat met de primer, template of inkomend dZTP, suggereert de structuur dat een verhoogde flexibiliteit, met name in het duimsubdomein, en een grotere sluithoek in het vingersubdomein de verlenging van de primer met de onnatuurlijke basis vergemakkelijken. paar.

Chim et al. recentelijk gerapporteerde ternaire structuren van een hyperthermofiele B-familie polymerase, een gemanipuleerde KOD-mutant, die TNA polymeriseert [152]. Gezien het wijdverbreide gebruik van hyperthermofielen van de B-familie in polymerase-engineering, zullen de structuren van de apo-, binaire en ternaire polymerasecomplexen nuttig zijn bij het ontwikkelen van hypothesen voor verder werk in het veld. Vervolgens gepubliceerde ternaire structuren van KOD en 9°N met DNA-primer en template en een inkomend dNTP [149, 153] suggereren mogelijke verklaringen voor de aanleg van hyperthermofiele archaeale B-familie polymerasen voor engineering: een ongewoon breed en positief geladen kanaal tussen de vinger en thumb-subdomeinen kunnen ruimte bieden voor substraatmodificaties met behoud van een sterke binding aan de sjabloon en hoge procesiviteit. Bovendien, terwijl de primertemplate-duplex een A-vorm in de actieve plaats van A-familie-polymerasen aanneemt, neemt het een B-vorm in KOD aan, wat mogelijk bijdraagt ​​aan de accommodatie van nucleotide-modificaties in de bredere hoofdgroef van de B-vorm duplex.

Rationele engineering van XNA-polymerasen: vertaling van mutaties over substraten en polymerasen

Er zijn talloze voorbeelden van overdraagbare mutaties over XNA-substraten en polymerasen. Een recent rapport [154] beschrijft de engineering van een eerder beschreven Taq-mutant om 2'-gemodificeerde XNA's beter op te nemen. Uit kinetische gegevens over de opname van verschillende 2'-gemodificeerde nucleotiden, werden relevante mutaties uit de literatuur gekozen op basis van de hypothese dat de snelheidsbeperkende stap herkenning van de gemodificeerde primerstreng zou kunnen zijn. Verschillende mutanten vertoonden verbeterde synthese van 2′F en 2′OMe en/of reverse transcriptie van 2′OMe-RNA. In een ander geval leverde diversificatie op acht "specificiteitsbepalende residuen" geselecteerd door computationele analyse, evolutionaire conservering en literatuurprecedent verbeterde polymerasen op voor RNA en TNA [75]. Verder toonde het testen van de topmutatiesets in de context van verschillende homologe B-familie polymerasen hun algemene bruikbaarheid aan en onthulde ook de structurele context waarin ze het beste functioneerden. Evenzo werd polymerasesynthese van steeds diverser wordende XNA's bereikt met een TNA-polymerase door de TNA-suiker te combineren met basemodificaties waarvan bekend is dat ze polymerase-compatibel zijn [31, 32]. Hoewel algemeen wordt aangenomen dat mutatie van geconserveerde residuen zeer schadelijk is, wordt het door dit en ander werk steeds duidelijker dat dergelijke mutaties de sleutel kunnen zijn bij het mogelijk maken van activiteit met onnatuurlijke substraten [75, 155].

Liu et al. onlangs gerapporteerde engineering van een polymerase om een ​​nieuw beschreven XNA, tPhoNA, te synthetiseren met zowel suiker- als backbone-modificaties [33]. Indrukwekkend, de polymerase-engineeringstrategie bestond uitsluitend uit opeenvolgende introductie en evaluatie van mutaties op posities waarvan bekend is dat ze de synthese voor andere XNA-substraten beïnvloeden. Hun succes is een bewijs van de groeiende kennisbasis op het gebied van polymerase-engineering en het buitengewone vermogen van een klein aantal specifieke sleutelmutaties om een ​​uitgebreid substraatspectrum te verlenen.

RNA-polymerasen zijn ook ontwikkeld om XNA's te synthetiseren. Er is aangetoond dat T7 RNAP inhoud-vergrote RNA kan transcriberen van DNA dat de Ds-Pa UPB bevat, evenals verder gemodificeerde Pa-basen [103]. Door een klein scherm van eerder geïdentificeerde mutaties, Kimoto et al. identificeerde een T7 RNAP-mutant die 2′-Furacil- en cytidinetrifosfaten bevat en een verbeterde opname van Pa-nucleotiden en hun analogen laat zien in moeilijke sequentiecontexten [93]. Verrassend genoeg lijken verschillende omvangrijke modificaties van het Pa-nucleotide, ontworpen om de chemische diversiteit voor aptamer- en ribozymselecties uit te breiden, zelfs betere substraten te zijn dan de oorspronkelijke Pa-trifosfaten. Evenzo werd onlangs aangetoond dat een Tgo-polymerasemutant die eerder is geëvolueerd om HNA te synthetiseren, HNA-nucleotiden incorporeert met verschillende aromatische modificaties op de uridinebase [35]. Ook hier vertoonden enkele van de omvangrijkere basismodificaties een superieure opname.

Omgekeerde transcriptie van XNA's

Identificatie van enzymen die in staat zijn om XNA's reverse te transcriberen, demonstreert het potentieel van deze uiteenlopende chemie als genetisch materiaal en is cruciaal voor in vitro selecties [156]. Sommige XNA's kunnen omgekeerd worden getranscribeerd door natuurlijke polymerasen (bijv. TNA en FANA door Bst-polymerase [157,158,159]). Als alternatief moeten technische benaderingen worden gevolgd [79, 88]. Een klein aantal mutaties in Tgo polymerase leverde een reverse transcriptase op met een over het algemeen uitgebreid substraatspectrum dat verschillende XNA's kan reverse transcriberen naar DNA [29, 78].

Analyse van XNA's en XNA-polymerasen

Een moeilijkheid bij het werken met XNA's is dat ze vaak onverenigbaar zijn met traditionele methoden voor nucleïnezuurmanipulatie of -analyse, zoals restrictie-enzymen en sequentietechnologieën. Een belangrijke parallelle inspanning voor de ontwikkeling van XNA's en XNA-polymerasen is dus de ontwikkeling van hulpmiddelen om ze te analyseren. De getrouwheid is bijvoorbeeld niet in detail geëvalueerd voor veel van de beschreven XNA-polymerasen. Een recente methode voor het testen van betrouwbaarheid meldde dat zelfs relatief kleine en natuurlijke RNA-modificaties de polymerase-foutpercentages aanzienlijk kunnen verhogen [160]. Deep sequencing is ook gebruikt om foutprofielen en het doorlezen van polymerase-sjablonen met backbone-modificaties te onderzoeken [161] en ontdekte dat sommige veelgebruikte isosterische modificaties, zoals fosforothioaten, significante kopieerfouten veroorzaakten. Deze getrouwheidsgegevens zijn een voorbode van een belangrijke beperking in de enzymatische XNA-synthese die waarschijnlijk zal moeten worden aangepakt naarmate het veld vordert. Aan de andere kant is het promiscue gedrag van polymerasen gebruikt om de aanwezigheid van epigenetische DNA- en RNA-modificaties te lezen en vast te leggen via verkeerde incorporatie "handtekeningen" bij de modificaties [162,163,164,165,166,167,168,169,170]. Bovendien werd onlangs gemeld dat het eerste exemplaar van directe sequencing van een XNA werd gesequenced met behulp van nanopore-technologie, zij het met relatief korte leeslengtes [171].

Een XNA die in het bijzonder wordt beperkt door een gebrek aan hulpmiddelen, is L-DNA. Dergelijk "spiegelbeeld"-DNA biedt zowel volledige orthogonaliteit in kenmerken en interacties op macromolecuulschaal, terwijl op chemisch niveau identieke eigenschappen als DNA behouden blijven. Dus enzymatische synthese van L-DNA vereist spiegelbeeldpolymerasen gemaakt van D-aminozuren. Zhu en collega's maakten eerst de D-vorm van het kleinste bekende polymerase, African Swine Fever Virus-polymerase X, en gebruikten het om L-DNA te synthetiseren, wat aantoont dat het polymerase strikt enantio-specifiek was zonder crossover-remming van D-nucleotidetrifosfaten [ 102]. De groep rapporteerde vervolgens de synthese van een mutant van het grotere thermostabiele Dpo4-polymerase met D-aminozuren, wat PCR-amplificatie van een L-DNA-product mogelijk maakte [99, 100]. Klussmann en collega's hadden ook melding gemaakt van de synthese van een D-Dpo4-mutant [101], die werd gebruikt om L-DNA-sequenties van genlengte samen te stellen. Een spiegelbeeldligase is ook gemeld [172]. Nucleïnezuren in spiegelbeeld zijn van enorm belang voor therapieën en worden actief nagestreefd in onderzoek en klinische ontwikkeling [173]. Het gebruik ervan blijft echter beperkt door het moeizame proces van het synthetiseren van D-polymerasen en de onverenigbaarheid van L-DNA met traditionele nucleïnezuurmanipulatietools.


Chemie in levende systemen

Het ontleden van complexe cellulaire processen vereist het vermogen om biomoleculen te volgen terwijl ze functioneren in hun natuurlijke habitat. Hoewel genetisch gecodeerde tags zoals GFP veel worden gebruikt om discrete eiwitten te controleren, kunnen ze aanzienlijke verstoringen van de structuur van een eiwit veroorzaken en hebben ze geen directe uitbreiding naar andere klassen van biomoleculen zoals glycanen, lipiden, nucleïnezuren en secundaire metabolieten. In de afgelopen jaren is er een alternatief hulpmiddel voor het labelen van biomoleculen ontstaan ​​uit de chemische biologie - de bioorthogonale chemische reporter. In een prototypisch experiment wordt een uniek chemisch motief, vaak zo klein als een enkele functionele groep, in het doelbiomolecuul opgenomen met behulp van de eigen biosynthetische machinerie van de cel. De chemische reporter wordt vervolgens covalent gemodificeerd op een zeer selectieve manier met een exogeen afgeleverde probe. Deze review belicht de ontwikkeling van bioorthogonale chemische reporters en reacties en hun toepassing in levende systemen.


3.2: Natuurlijke en onnatuurlijke groepen - Biologie

Antropologie

Mensen en culturen van vroeger en nu

Archeologie

Mensen en artefacten uit de oudheid

Astronomie

Het heelal en alles erin

Biodiversiteit

De rijke verscheidenheid aan leven op aarde

Brein

Het orgaan in onze schedels

Klimaatverandering

Langdurige veranderingen in de mondiale temperatuur

Aarde

De dynamische planeet die we thuis noemen

Genetica

Hoe genen van generatie op generatie worden doorgegeven

Marine biologie

Microbiologie

Bacteriën, virussen en andere micro-organismen

PaleontOlogie

Dinosaurussen en andere dingen die lang geleden leefden

Natuurkunde

Materie en haar beweging door ruimte en tijd

Water

De vloeistof die het leven op aarde mogelijk maakt

Zoölogie

Alle dieren, van insecten tot zoogdieren

OLogy-kaart van de dag: Wist u?

Koala's zijn geen beren. Het zijn buideldieren en zijn nauwer verwant aan kangoeroes.

Sommige meteorieten zijn kleine stukjes van de maan.

Als ze zouden smelten, zouden de ijskappen die Antarctica bedekken de wereldzeespiegel met bijna 70 meter (230 voet) doen stijgen.

Vleermuizen zijn de enige zoogdieren die echt kunnen vliegen.

Vuurvliegjes zijn helemaal geen vliegen. Het zijn kevers!

Antarctica is een continent omgeven door de oceaan. Het noordpoolgebied is het tegenovergestelde, een uitgestrekte oceaan omringd door continenten.

"Vallende sterren" zijn eigenlijk meteoren.

Veel sauropoden kregen zo vaak als een keer per maand nieuwe tanden, omdat de oude versleten waren.

Sommige meteorieten zijn zo oud als het zonnestelsel.

Gedurende de eerste vijf maanden in de baarmoeder vormen zich elke minuut een half miljoen neuronen.

Eeneiige tweelingen hebben exact dezelfde genen, maar hun vingerafdrukken zijn uniek.


Wat is kunstmatige selectie?

Kunstmatige selectie is het selectief fokken van dieren en planten om een ​​nageslacht te produceren met wenselijke en erfelijke karakters. Kunstmatige selectie is een door de mens gemaakt selectieproces van gewenste karakters en wordt voornamelijk gebruikt in vee en verbeterde gewassen. Boeren gebruikten kunstmatige veredeling zelfs vóór Darwins ontdekking van de genetica om de erfelijke eigenschappen te behouden die ze wilden in zowel dieren als planten. De gunstige eigenschappen zoals het vermogen om meer melk te produceren bij runderen, de versnelde spiergroei, exotische huisdieren zoals Savannah-kat en kleine honden zoals Chihuahua worden geproduceerd door kunstmatige fokkerij. Een Belgische koe wordt in stand gehouden door selectief fokken vanwege de versnelde spiergroei.

Figuur 3: Een Belgische koe

Bovendien wordt kunstmatige selectie gebruikt bij de productie van onnoemelijke diversiteit in planten. Maïs-, tarwe- en sojabonenstammen worden ontwikkeld door kunstmatige selectie van gunstige eigenschappen in de landbouw. Broccoli, Brussels sprouts, cabbage, cauliflower, collards, and kale are produced by the careful selective breeding of wild mustard. Roses and orchids are also cultivated by selective breeding. Artificial selection can also produce various colors in carrot roots.

Figure 4: Carrots with multiple colored roots


2. Kin Selection and Inclusive Fitness

The basic idea of kin selection is simple. Imagine a gene which causes its bearer to behave altruistically towards other organisms, e.g. by sharing food with them. Organisms without the gene are selfish&mdashthey keep all their food for themselves, and sometimes get handouts from the altruists. Clearly the altruists will be at a fitness disadvantage, so we should expect the altruistic gene to be eliminated from the population. However, suppose that altruists are discriminating in who they share food with. They do not share with just anybody, but only with their relatives. This immediately changes things. For relatives are genetically similar&mdashthey share genes with one another. So when an organism carrying the altruistic gene shares his food, there is a certain probability that the recipients of the food will also carry copies of that gene. (How probable depends on how closely related they are.) This means that the altruistic gene can in principle spread by natural selection. The gene causes an organism to behave in a way which reduces its own fitness but boosts the fitness of its relatives&mdashwho have a greater than average chance of carrying the gene themselves. So the overall effect of the behaviour may be to increase the number of copies of the altruistic gene found in the next generation, and thus the incidence of the altruistic behaviour itself.

Though this argument was hinted at by Haldane in the 1930s, and to a lesser extent by Darwin in his discussion of sterile insect castes in Het ontstaan ​​van soorten, it was first made explicit by William Hamilton (1964) in a pair of seminal papers. Hamilton demonstrated rigorously that an altruistic gene will be favoured by natural selection when a certain condition, known as Hamilton's rule, is satisfied. In its simplest version, the rule states that B > C/R, waar C is the cost incurred by the altruist (the donor), b is the benefit received by the recipients of the altruism, and r is the co-efficient of relationship between donor and recipient. The costs and benefits are measured in terms of reproductive fitness. The co-efficient of relationship depends on the genealogical relation between donor and recipient&mdashit is defined as the probability that donor and recipient share genes at a given locus that are &lsquoidentical by descent&rsquo. (Two genes are identical by descent if they are copies of a single gene in a shared ancestor.) In a sexually reproducing diploid species, the value of r for full siblings is ½, for parents and offspring ½, for grandparents and grandoffspring ¼, for full cousins 1/8, and so-on. The higher the value of r, the greater the probability that the recipient of the altruistic behaviour will also possess the gene for altruism. So what Hamilton's rule tells us is that a gene for altruism can spread by natural selection, so long as the cost incurred by the altruist is offset by a sufficient amount of benefit to sufficiently closed related relatives. The proof of Hamilton's rule relies on certain non-trivial assumptions see Frank 1998, Grafen 1985, 2006, Queller 1992a, 1992b, Boyd and McIlreath 2006 and Birch forthcoming for details.

Though Hamilton himself did not use the term, his idea quickly became known as &lsquokin selection&rsquo, for obvious reasons. Kin selection theory predicts that animals are more likely to behave altruistically towards their relatives than towards unrelated members of their species. Moreover, it predicts that the rang of altruism will be greater, the closer the relationship. In the years since Hamilton's theory was devised, these predictions have been amply confirmed by empirical work. For example, in various bird species, it has been found that &lsquohelper&rsquo birds are much more likely to help relatives raise their young, than they are to help unrelated breeding pairs. Similarly, studies of Japanese macaques have shown that altruistic actions, such as defending others from attack, tend to be preferentially directed towards close kin. In most social insect species, a peculiarity of the genetic system known as &lsquohaplodiploidy&rsquo means that females on average share more genes with their sisters than with their own offspring. So a female may well be able to get more genes into the next generation by helping the queen reproduce, hence increasing the number of sisters she will have, rather than by having offspring of her own. Kin selection theory therefore provides a neat explanation of how sterility in the social insects may have evolved by Darwinian means. (Note, however, that the precise significance of haplodiploidy for the evolution of worker sterility is a controversial question see Maynard Smith and Szathmary 1995 ch.16, Gardner, Alpedrinha and West 2012.)

Kin selection theory is often presented as a triumph of the &lsquogene's-eye view of evolution&rsquo, which sees organic evolution as the result of competition among genes for increased representation in the gene-pool, and individual organisms as mere &lsquovehicles&rsquo that genes have constructed to aid their propagation (Dawkins 1976, 1982). The gene's eye-view is certainly the easiest way of understanding kin selection, and was employed by Hamilton himself in his 1964 papers. Altruism seems anomalous from the individual organism's point of view, but from the gene's point of view it makes good sense. A gene wants to maximize the number of copies of itself that are found in the next generation one way of doing that is to cause its host organism to behave altruistically towards other bearers of the gene, so long as the costs and benefits satisfy the Hamilton inequality. But interestingly, Hamilton showed that kin selection can also be understood from the organism's point of view. Though an altruistic behaviour which spreads by kin selection reduces the organism's personal fitness (by definition), it increases what Hamilton called the organism's inclusief fitness. An organism's inclusive fitness is defined as its personal fitness, plus the sum of its weighted effects on the fitness of every other organism in the population, the weights determined by the coefficient of relationship r. Given this definition, natural selection will act to maximise the inclusive fitness of individuals in the population (Grafen 2006). Instead of thinking in terms of selfish genes trying to maximize their future representation in the gene-pool, we can think in terms of organisms trying to maximize their inclusive fitness. Most people find the &lsquogene's eye&rsquo approach to kin selection heuristically simpler than the inclusive fitness approach, but mathematically they are in fact equivalent (Michod 1982, Frank 1998, Boyd and McIlreath 2006, Grafen 2006).

Contrary to what is sometimes thought, kin selection does not require that animals must have the ability to discriminate relatives from non-relatives, less still to calculate coefficients of relationship. Many animals can in fact recognize their kin, often by smell, but kin selection can operate in the absence of such an ability. Hamilton's inequality can be satisfied so long as an animal behaves altruistically towards other animals that are in feite its relatives. The animal macht achieve this by having the ability to tell relatives from non-relatives, but this is not the only possibility. An alternative is to use some proximal indicator of kinship. For example, if an animal behaves altruistically towards those in its immediate vicinity, then the recipients of the altruism are likely to be relatives, given that relatives tend to live near each other. No ability to recognize kin is presupposed. Cuckoos exploit precisely this fact, free-riding on the innate tendency of birds to care for the young in their nests.

Another popular misconception is that kin selection theory is committed to &lsquogenetic determinism&rsquo, the idea that genes rigidly determine or control behaviour. Though some sociobiologists have made incautious remarks to this effect, evolutionary theories of behaviour, including kin selection, are not committed to it. So long as the behaviours in question have a genetical onderdeel, i.e. are influenced to some extent by one or more genetic factor, then the theories can apply. When Hamilton (1964) talks about a gene which &lsquocauses&rsquo altruism, this is really shorthand for a gene which increases the probability that its bearer will behave altruistically, to some degree. This is much weaker than saying that the behaviour is genetically &lsquodetermined&rsquo, and is quite compatible with the existence of strong environmental influences on the behaviour's expression. Kin selection theory does not deny the truism that all traits are affected by both genes and environment. Nor does it deny that many interesting animal behaviours are transmitted through non-genetical means, such as imitation and social learning (Avital and Jablonka 2000).

The importance of kinship for the evolution of altruism is very widely accepted today, on both theoretical and empirical grounds. However, kinship is really only a way of ensuring that altruists and recipients both carry copies of the altruistic gene, which is the fundamental requirement. If altruism is to evolve, it must be the case that the recipients of altruistic actions have a greater than average probability of being altruists themselves. Kin-directed altruism is the most obvious way of satisfying this condition, but there are other possibilities too (Hamilton 1975, Sober and Wilson 1998, Bowles and Gintis 2011, Gardner and West 2011). For example, if the gene that causes altruism also causes animals to favour a particular feeding ground (for whatever reason), then the required correlation between donor and recipient may be generated. It is this correlation, however brought about, that is necessary for altruism to evolve. This point was noted by Hamilton himself in the 1970s: he stressed that the coefficient of relationship of his 1964 papers should really be replaced with a more general correlation coefficient, which reflects the probability that altruist and recipient share genes, whether because of kinship or not (Hamilton 1970, 1972, 1975). This point is theoretically important, and has not always been recognized but in practice, kinship remains the most important source of statistical associations between altruists and recipients (Maynard Smith 1998, Okasha 2002, West et al. 2007).

2.1 A Simple Illustration: the Prisoner's dilemma

The fact that correlation between donor and recipient is the key to the evolution of altruism can be illustrated via a simple &lsquoone shot&rsquo Prisoner's dilemma game. Consider a large population of organisms who engage in a social interaction in pairs the interaction affects their biological fitness. Organisms are of two types: selfish (S) and altruistic (A). The latter engage in pro-social behaviour, thus benefiting their partner but at a cost to themselves the former do not. So in a mixed (S,A) pair, the selfish organism does better&mdashhe benefits from his partner's altruism without incurring any cost. However, (A,A) pairs do better than (S,S) pairs&mdashfor the former work as a co-operative unit, while the latter do not. The interaction thus has the form of a one-shot Prisoner's dilemma, familiar from game theory. Illustrative payoff values to each &lsquoplayer&rsquo, i.e., each partner in the interaction, measured in units of biological fitness, are shown in the matrix below.

Speler 2
Altruist Selfish
Player 1 Altruist 11,11 0,20
Selfish 20,0 5,5
Payoffs for (Player 1, Player 2) in units of reproductive fitness

The question we are interested in is: which type will be favoured by selection? To make the analysis tractable, we make two simplifying assumptions: that reproduction is asexual, and that type is perfectly inherited, i.e., selfish (altruistic) organisms give rise to selfish (altruistic) offspring. Modulo these assumptions, the evolutionary dynamics can be determined very easily, simply by seeing whether the S of de EEN type has higher fitness, in the overall population. The fitness of the S type, W(S), is the weighted average of the payoff to an S when partnered with an S and the payoff to an S when partnered with an EEN, where the weights are determined by the probability of having the partner in question. Daarom,

(The conditional probabilities in the above expression should be read as the probability of having a selfish (altruistic) partner, given that one is selfish oneself.)

Similarly, the fitness of the EEN type is:

From these expressions for the fitnesses of the two types of organism, we can immediately deduce that the altruistic type will only be favoured by selection if there is a statistical correlation between partners, i.e., if altruists have greater than random chance of being paired with other altruists, and similarly for selfish types. For suppose there is no such correlation&mdashas would be the case if the pairs were formed by random sampling from the population. Then, the probability of having a selfish partner would be the same for both S en EEN types, i.e., P(S partner/S) = P(S partner/EEN). Similarly, P(EEN partner/S) = P(EEN partner/EEN). From these probabilistic equalities, it follows immediately that W(S) is greater than W(EEN), as can be seen from the expressions for W(S) en W(EEN) above so the selfish type will be favoured by natural selection, and will increase in frequency every generation until all the altruists are eliminated from the population. Therefore, in the absence of correlation between partners, selfishness must win out (cf. Skyrms 1996). This confirms the point noted in section 2&mdashthat altruism can only evolve if there is a statistical tendency for the beneficiaries of altruistic actions to be altruists themselves.

If the correlation between partners is sufficiently strong, in this simple model, then it is possible for the condition W(EEN) > W(S) to be satisfied, and thus for altruism to evolve. The easiest way to see this is to suppose that the correlation is perfect, i.e., selfish types are always paired with other selfish types, and ditto for altruists, so P(S partner/S) = P(EEN partner/EEN) = 1. This assumption implies that W(EEN)=11 and W(S)=5, so altruism evolves. With intermediate degrees of correlation, it is also possible for the condition W(S) > W(EEN) to be satisfied, given the particular choice of payoff values in the model above.

This simple model also highlights the point made previously, that donor-recipient correlation, rather than genetic relatedness, is the key to the evolution of altruism. What is needed for altruism to evolve, in the model above, is for the probability of having a partner of the same type as oneself to be sufficiently larger than the probability of having a partner of opposite type this ensures that the recipients of altruism have a greater than random chance of being fellow altruists, i.e., donor-recipient correlation. Whether this correlation arises because partners tend to be relatives, or because altruists are able to seek out other altruists and choose them as partners, or for some other reason, makes no difference to the evolutionary dynamics, at least in this simple example.


3.2: Natural and un-natural groups - Biology

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

Graduate School of Pharmaceutical Science, Tokushima University

2018 Volume 66 Issue 2 Pages 132-138

  • Published: February 01, 2018 Received: August 29, 2017 Released on J-STAGE: February 01, 2018 Accepted: - Advance online publication: - Revised: -

(compatible with EndNote, Reference Manager, ProCite, RefWorks)

(compatible with BibDesk, LaTeX)

In this review, we have summarized the research effort into the development of unnatural base pairs beyond standard Watson–Crick (WC) base pairs for synthetic biology. Prior to introducing our research results, we present investigations by four outstanding groups in the field. Their research results demonstrate the importance of shape complementarity and stacking ability as well as hydrogen-bonding (H-bonding) patterns for unnatural base pairs. On the basis of this research background, we developed unnatural base pairs consisting of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-NS]pyrimidines and 1,8-naphthyridines, d.w.z., Im : Na pairs. Since Im bases are recognized as ring-expanded purines and Na bases are recognized as ring-expanded pyrimidines, Im : Na pairs are expected to satisfy the criteria of shape complementarity and enhanced stacking ability. In addition, these pairs have four non-canonical H-bonds. Because of these preferable properties, ImN N : NaO O , one of the Im : Na pairs, is recognized as a complementary base pair in not only single nucleotide insertion, but also the PCR.

Recently, work by the Human Genome Project-Write, which focuses on synthesizing human genomes, has started. 1) Rewriting entire human genomes will deepen our understanding of the genetic code and have an impact on human health. In this manner, synthetic biology is a bottom-up-type research field that deals with the preparation of materials that comprise life systems. As only two base pairs have been selected during the evolution of life, d.w.z., adenine (A) : thymine (T) and guanine (G) : cytosine (C) pairs, these represent ideal genetic polymers. The specific formation of hydrogen bonds (H-bonds) in the A : T pair (two H-bonds) and G : C pair (three H-bonds) is the most fundamental rule of genetic information. In 1962, with surprising foresight, Rich proposed the possibility of an extra artificial base pair, d.w.z., isoguanine (isoG, 6-amino-2-oxopurine) and isocytosine (isoC, 2-amino-4-oxopurine), representing fifth and sixth DNA nucleobases. 2) The artificially designed isoG : isoC pair has three H-bonds with the specific proton donor (D) and proton acceptor (A) geometry [DDA : AAD], which is different from those in the A : T pair ([DA : AD]) and the G : C pair ([ADD : DAA]) (Fig. 1). If an extra base pair can function selectively in replication, transcription, and translation alongside natural Watson–Crick (WC) base pairs, it could potentially allow expansion of the genetic code. Thus, the creation of unnatural base pairs is a challenging and ideal research theme in synthetic biology. Herein, research into the development of unnatural base pairs and their applications are described.

Prior to presenting our unnatural base pair studies, the work of four famous and pioneering groups focusing on unnatural base pairs is introduced.

2.1. Unnatural Base Pairs with Non-standard H-Bonding Geometries Benner’s Group

In 1989, Benner and colleagues synthesized isoG en isoC nucleosides and their triphosphates with the goal of expanding the genetic alphabet 3) (Fig. 1). De isoG : isoC pair was recognized as a complementary base pair by polymerases both in in vitro replication and transcription systems. 4) They also designed other unnatural base pairs with different H-bonding patterns, such as the x : κ paar. 5) Additionally, they succeeded in incorporating the unnatural amino acid 3-iodotyrosine into a peptide by using a pair of 54-mer mRNA comprising isoC and tRNA with an isoGUC anticodon in in vitro translation systems. 6) These were the first studies to succeed in artificially rebuilding the central dogma using unnatural base pairs, indicating that the alteration of H-bonding geometries in base pairs is a promising strategy for creating a new unnatural base pairs. However, the selectivity of the isoG : isoC pair in enzymatic replication was unsatisfactory. Dit is zo omdat isoG has a problem with tautomerism, in that the enol form of isoG has a [DAD] H-bonding pattern that is complementary to that of T. 4) In 2005, to address this drawback of isoG, they replaced natural T with 2-thioT (T s ). 7) Because of the bulkiness and H-bonding properties (weak proton acceptability) of the thione, T s is less likely to mispair with the tautomer of isoG than natural T. Fidelity per doubling of the isoG : isoC pair along with the A : T s pair in the PCR was improved by around 98%, although that with natural A : T was 93%. 7) However, when using an unnatural base pair with 98% replication fidelity, the retention of the unnatural base pair in its amplified DNA fragment after a 20-cycle PCR is decreased to 67% (d.w.z., 0.98 20 =ca. 0.67). Because the error rate for natural WC pairing in replication is ca. 10 −6 errors/bp, highly exclusive selectivity of unnatural base pairs is required. Thus, they also created another unnatural base pair comprising 2-aminoimidazo[1,2-een]-1,3,5-triazin-4(8H)-one (P) and 6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone (Z). 8) The P : Z pair, which has [AAD : DDA] H-bonding geometry, exhibits up to 99.8% fidelity per doubling without using the A : T s pair because, unlike isoG, Z does not tautomerize. 9) Recently, they applied the six-letter genetic system with the P : Z pair to the cell-systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) system and succeeded in obtaining highly active aptamers against HepG2 liver cancer cells. 10)

2.2. Non-hydrogen-Bonded Unnatural Base Pairs Kool’s Group

During the same decade as Benner’s pioneering works, Kool et al. have explored the possibility of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1998, they created an unnatural base pair comprising 4-methylbenzimidazole (Z) 11) and 2,4-difluorotoluene (F) as steric isosteres of the natural A : T pair 12,13) (Fig. 2A). in een in vitro replication system, Z en F were equally replaced with natural A and T but not G and C, demonstrating the importance of shape complementary and stacking interactions in addition to H-bonding in base pairing. Additionally, they designed a modified Z base, 9-methyl-1H-imidazo[4,5-B]pyridine (Q), that has a proton acceptor corresponding to the N3 atom. 14) Because the incorporation efficiency of Q by Klenow fragment (KF) DNA polymerase is superior to that of Z, the importance of proton acceptors in the minor groove for unnatural base pair design is also demonstrated.

To further evaluate the importance of shape complementarity in base pairing, they also created size-expanded (benzo-fused) WC-like base pairs, such as xA : T and A : xT pairs (termed xDNA), that have the same H-bonding geometry as natural WC base pairs but with their pairing edges shifted outward by 2.4 Å (d.w.z., the width of benzene) 15,16) (Fig. 2B). KF polymerase incorporated natural nucleoside triphosphate (dNTP) opposite xDNA bases in a DNA template with an efficiency ca. 1000-fold lower than that of natural pairs, 16) and endogenous Escherichia coli (E coli) enzymes accurately transcribed xDNA to encode the bacteria phenotype. 17)

2.3. Creation of a Semi-synthetic Organism with an Unnatural Base Pair Romesberg’s Group

Romesberg and colleagues have also developed various kinds of non-H-bonded unnatural base pairs. In 1999, they reported the self-complementary 7-propynylisocarbostyril (PICS) : PICS pair 18) (Fig. 3). Wanneer PICS : PICS base pairs are incorporated into DNA, the resulting duplex shows high thermal stability, and KF polymerase recognizes the PICS : PICS pair as a complementary base pair. However, further replication reactions after PICS : PICS base pairing are terminated because PICS bases overlap with each other, indicating structural change in the DNA duplex. Consequently, they explored more than 100 kinds of unnatural base pairs 19–25) and succeeded in developing 5SICS : MMO2 en 5SICS : NaM pairs, which are replicable unnatural base pairs in the PCR. 26–28) In 2014, they reported the creation of a semi-synthetic organism containing the 5SICS : NaM base pair. In this work, an exogenously expressed nucleoside triphosphate transporter imported d5SICS and dNaM triphosphates efficiently into E coli, and an endogenous replication system used them in the genetic codes. 29) This report had a great impact on synthetic biology, and some researchers consider the created organism to be “alien.”

2.4. Unnatural Base Pair as a Powerful Tool for Creating Highly Functional Nucleic Acids Hirao’s Group

Hirao et al. have also focused on the creation of unnatural base pairs that function in replication, transcription, and translation in the same way as natural WC base pairs. Their unnatural base pairs were developed by exploiting the concept of steric hindrance. In their 2-amino-6-(2-thienyl)purine (s) : 2-oxo-1H-pyridine (ja) pair, the purine-like s has a bulky substituent at the major groove side 30,31) (Fig. 4). Dus de s : ja pair is selectively recognized as a complementary base pair by KF polymerase in in vitro replication systems. Furthermore, in 2002 they succeeded in synthesizing the Ras protein modified with 3-iodotyrosine from a DNA template containing the s base by combining T7 polymerase transcription and E coli in vitro translation systems. 32) They also developed the Ds : Pa base pair, in which H-bonding atoms and substituents located at the base-pairing side are excluded. 33) The replication selectivity of the Ds : Pa pair is superior to that of the s : ja pair, and the Ds : Pa pair can be amplified in the PCR with over 99% fidelity per doubling using γ-amino triphosphates of Ds and A. 33) Concerning selectivity in replication, their unnatural base pairs exhibit the best performances among the reported unnatural base pairs. The low misincorporation rate of the recently developed Ds : diol1-Px pair (5×10 −5 errors/bp) is close to the mispairing error rate of natural WC pairs (2×10 −5 errors/bp). 34,35) By making use of this superior property of the Ds : diol1-Px pair, they succeeded in obtaining a DNA aptamer containing the Ds base against human protein target, vascular endothelial cell growth factor-165 (VEGF-165). 36) Because the affinities of aptamers that have Ds bases are >100-fold improved over those of aptamers containing only natural bases, the potential of genetic alphabet expansion as a powerful tool for creating highly functional nucleic acids is demonstrated.

In contrast to the research described above, we began our unnatural base pair studies to address the simple question : why did WC base pairs come to contain two or three H-bonds during the evolution of life? To answer this, we have explored four H-bonding base pairs. 37–41) As purine-type nucleobases, a series of imidazo[5′,4′:4.5]pyrido[2,3-NS]pyrimidines (Im) were designed, 37) while 1,8-naphthyridines (Na) were designed as their complementary pyrimidine nucleobases. 38) For the first generation of our four-H-bonding unnatural base pairs, two Im : Na pairs, d.w.z., ImN O : NaO N en ImO N : NaN O , which have alternate H-bonding geometries, were developed. As can be seen in Fig. 5a, these pairs have four non-canonical H-bonds and expanded aromatic surfaces, and they satisfy the shape complementarity criterion like WC base pairs. Because of the contributions of these effects, DNA duplexes containing these pair(s) are significantly thermally stabilized (ca. +8°C/pair). 38) In addition, both pairs are recognized by KF polymerase as complementary in single nucleotide insertion. However, the kinetic parameters determined for their 5′-triphosphates revealed that the efficiencies of incorporation for ImN O : NaO N en ImO N : NaN O pairs are 1–2 orders of magnitude lower than those of natural A : T and G : C pairs. Furthermore, misincorporation of natural dNTP, for example, that of 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate (dATP) against NaN O in the template was clearly observed at the same efficiency as that of ImO N TP tegen NaN O in the template owing to the possible formation of an A : NaN O pair with two H-bonds 42,43) (Fig. 5b).

To improve efficiency and selectivity, a new Im : Na pair, d.w.z., ImN N : NaO O , has been envisioned 39,44) (Fig. 5c). This pair has a [DAAD : ADDA] H-bonding geometry, and thus is expected to avoid the misincorporation of natural A and G (Fig. 5d). The chemistry and enzymatic behavior of the ImN N : NaO O pair is described below.

3.1. Synthesis of the Nucleoside Units for the ImN N : NaO O Pair

The most straightforward synthesis of ImN N nucleoside 1 is thought to be through intramolecular cyclization of the 5-pyrimidinylimidazole nucleoside, which can be prepared via Stille coupling between the 5-iodoimidazole nucleoside 2 and (tributylstannyl)pyrimidine 3 (Chart 1). When a mixture of 2 prepared from 2′-deoxyinosine and 3 prepared from 2,4-dichloropyrimidine is heated in N,N-dimethylformamide (DMF) in the presence of tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0)-chloroform adduct (dba3Pd2·CHCl3), a mixture of coupling product 4 and a spontaneously cyclized tricyclic product 5 is obtained. Subsequent treatment of the mixture under basic conditions converges the mixture to the tricyclic product 5. Finally, treatment of 5 with a mixture of 1,4-dioxane and NH4OH gives the desired ImN N nucleoside 1 in good yield. 37) The resulting 1 is then converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate under the appropriate conditions. 44,45)

Reagents and conditions: (a) dba3Pd2·CHCl3, DMF, 100°C (b) Na2CO3, aq. EtOH, 80°C (c) NH4OH/1,4-dioxane, 100°C.

For the synthesis of NaO O nucleoside 6, which is an unusual C-nucleoside, the palladium-catalyzed Heck reaction was envisioned. As illustrated in Chart 2, 3-iodo-1,8-naphthyridine derivative 7 prepared from 2-amino-7-hydroxy-1,8-naphthyridine and glycal 8 are prepared. Then, Heck coupling of 7 met 8 in the presence of palladium acetate and triphenylarsine followed by deprotection and stereoselective reduction affords 1,8-naphthyridine C-nucleoside 9. After protection of the hydroxyl groups with silyl groups to give 10, the substituent at the 2-position is converted into an acetoxy group via 11. Finally, treatment of the resulting 12 with methanolic ammonia at 60°C in a sealed tube gives the desired NaO O nucleoside 6 in good yield. In a similar manner as for 1, 6 is converted into the corresponding phosphoramidite unit and 5′-triphosphate for enzymatic evaluation. 39,45)

Reagents and conditions: (a) Pd(OAc)2, AsPh3, Bu3N, DMF, 60°C (b) TBAF, THF (c) NaBH(OAc)3, AcOH, CH3CN (d) TIPSCl, imidazole, DMF, 55°C (e) NH3/MeOH, 80°C (f) NaNO2, AcOH (g) NH3/MeOH, 80°C.

3.2. Investigation of Single Nucleotide Insertion with the ImN N : NaO O Pair

To investigate the efficiency and selectivity of the newly designed ImN N : NaO O pair in in vitro replication systems, we examined single nucleotide insertion using KF polymerase, and the kinetic parameters, such as the Michaelis constant (Km), the maximum rate of the enzyme reaction (Vmax), and the incorporation efficiency (Vmax/Km), for the ImN N : NaO O pair were determined and compared with those of the two previous Im : Na pairs 45) (Fig. 6). As discussed above, the values of Vmax/Km voor de ImN O : NaO N pair are 1–2 orders of magnitude lower than those of the natural A : T pair (6.0×10 7 –9.0×10 7 % min −1 M −1 ), as presented in the first row of Fig. 6. This result is thought to be due to the fact that the NaO N base lacks a proton acceptor corresponding to the O2 atom of the natural pyrimidine base. Voor de ImO N : NaN O pair, the Vmax/Km values are better than those for the ImN O : NaO N pair (second row in Fig. 6). However, as well as the desired ImO N , undesired A is incorporated against NaN O in the template with a comparable Vmax/Km value (Fig. 5b).

a) Incorporation of dYTP against a series of Im bases in the template. b) Incorporation of dYTP against a series of Na bases in the template. a n.d.=not determined.

Concerning incorporation efficiencies, the Vmax/Km values for the ImN N : NaO O pair are superior to those for the ImN O : NaO N en ImO N : NaN O pairs because the ImN N en NaO O bases have proton acceptors at positions corresponding to the N3 of a purine and the O2 of a pyrimidine, respectively. tevens de ImN N : NaO O pair has higher thermal stability than the two previous Im : Na pairs owing to the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern. 39) The preferable base-pairing properties of the ImN N : NaO O pair lead to it having the highest incorporation efficiency among the three Im : Na pairs. With respect to specificity, misincorporations of natural A and/or G against ImN N in the template are controlled by the [DAAD : ADDA] H-bonding pattern of the ImN N : NaO O paar. The efficiency of ImN N TP incorporation against NaO O is at least ten-times higher than those of natural dATP and 2′-deoxyguanosine 5′-triphosphate (dGTP) incorporations. Thus, as expected from Fig. 5d, formation of both A : NaO O and G : NaO O should be negligible owing to the NH proton repulsion between the 6-amino group of A and N8 of NaO O , and that between N1 of G and N1 of NaO O , respectievelijk.

3.3. PCR Amplification with ImN N : NaO O Pair

To apply the newly developed ImN N : NaO O pair to synthetic biology research like that reported by the four aforementioned groups, this pair should be viable in PCR amplification. Thus, according to the method reported by Hirao et al., 34) PCR involving the ImN N : NaO O pair was examined under various dNTP conditions (Fig. 7a).

(a) Schematics of the template and primers, and the resulting amplicon. Gel electrophoresis of PCR products obtained using Taq DNA polymerase (b), Deep Vent exo − DNA polymerase (c), Deep Vent exo + DNA polymerase (d), and Pfx 50 DNA polymerase (e) under different dNTP conditions.

First, when Taq DNA polymerase, which is a standard thermophilic DNA polymerase for routine PCR, is used, a 75 base-pair amplicon in the presence of ImN N TP and NaO O TP along with all four kinds of dNTPs is successfully obtained (Fig. 7b, lane 4). However, similar PCR products are observed under the conditions lacking ImN N TP (lane 3), indicating that inaccurate amplification occurs, presumably owing to misincorporation of natural A and/or G against NaO O in the resulting DNA fragment. Thus, we screened suitable thermophilic DNA polymerases, and typical results are shown in Figs. 7c–e. Exonuclease-deficient Deep Vent (Deep Vent exo − ) DNA polymerase gives the full-length amplicon in both the presence and absence of NaO O TP (Fig. 7c). Conversely, the same polymerase with 3′→5′ exonuclease activity (Deep Vent exo + ) preferentially affords the PCR product in the presence of all 5′-triphosphates (Fig. 7d), suggesting that the proofreading activity identifies mismatched base pairs with natural nucleobases and corrects them to the ImN N : NaO O paar. It has been reported that the proofreading activity of DNA polymerases improves the accuracy of incorporating unnatural base pair analogs, 32,33) and the benefits of this activity are apparent in our case.

To further evaluate the fidelity of the ImN N : NaO O pair in PCR amplification, we sequenced the resulting PCR product according to methods reported by the groups of Benner 26) and Hirao. 34) As a result, the lowest total mutation rates of the ImN N : NaO O pair is observed when using Pfx 50 DNA polymerase, and it is estimated to be ca. 6% after 15 PCR cycles (fidelity ≈0.995 per doubling) (the analysis of PCR products by gel electrophoresis is shown in Fig. 7d). Although the replication fidelity of the ImN N : NaO O pair is slightly inferior to those of other unnatural base-pair analogs, 8,9,26,28,34,46,47) it is strongly indicated that the ImN N : NaO O pair acts as an orthogonal base pair for WC base pairs during PCR amplification.


Bekijk de video: Organisatieniveaus (Mei 2022).


Opmerkingen:

  1. Hovsep

    Echt?

  2. Raedwald

    Mijn excuses voor het bemoeien met ... maar dit onderwerp staat heel dicht bij mij.Ik kan helpen met het antwoord.

  3. Jordanna

    Het lijkt me een goed idee. Ik ben het met je eens.

  4. Laheeb

    Ik zou de auteur met minachting de hand hebben geschud, gelukkig is zijn blog een wonder.

  5. JoJok

    daar ben ik het niet mee eens



Schrijf een bericht